反向代謝工程

甘油是生物柴油的副產(chǎn)物,因其價(jià)格低廉和高還原性,成為生物發(fā)酵的重要碳源.為了進(jìn)一步提高工程菌對(duì)甘油的利用能力,從而提高萜類化合物的合成能力,本研究從β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌CAR015出發(fā),對(duì)其甘油代謝途徑的多個(gè)基因進(jìn)行了調(diào)控.首先敲除了編碼3-磷酸甘油抑制子的glpR基因,然后分別用M1-37、M1-46和M1-93三個(gè)不同強(qiáng)度的人工調(diào)控元件對(duì)glpFK,glpD和tpiA三組基因進(jìn)行單基因調(diào)控和多基因組合調(diào)控.研究發(fā)現(xiàn)用M 1-46調(diào)控glpD基因后p-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100％;調(diào)控tpipA基因后β-胡蘿卜素產(chǎn)量略有提高;調(diào)控glpFK基因后p-胡蘿卜素產(chǎn)量略有降低.說(shuō)明G1pD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟.Q-PCR結(jié)果表明,降低甘油代謝途徑的glpD和glpFK基因轉(zhuǎn)錄水平,增加tpiA基因轉(zhuǎn)錄水平,可以增加細(xì)胞生長(zhǎng)速度、提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量,可能是因?yàn)闇p少了丙酮醛毒性所致.組合調(diào)控glpD和tpiA基因,獲得β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高菌株Gly003,其p-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)72.45 mg/L,產(chǎn)率達(dá)18.65 mg/g每克干細(xì)胞,分別是出發(fā)菌株CAR015的5.23倍和1.99倍.總之,GlpD是甘油代謝途徑中的關(guān)鍵限速步驟,適當(dāng)強(qiáng)度調(diào)控glpD,可以有效提高重組大腸桿菌的p-胡蘿卜素產(chǎn)量.

一碳化合物(甲醇或甲烷)高值化轉(zhuǎn)化是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的重要研究熱點(diǎn)。甲基營(yíng)養(yǎng)菌是一類以甲醇為碳源和能源生長(zhǎng)的革蘭氏陰性菌,隨著基因組測(cè)序的開展和各類組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以扭脫甲基桿菌為代表的甲基營(yíng)養(yǎng)菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)途徑和相關(guān)功能基因逐漸明晰。近年來(lái),甲基營(yíng)養(yǎng)菌中包括基因過(guò)表達(dá)、基因敲除整合等遺傳操作工具的完善以及各種基因調(diào)控元件的開發(fā),為甲基營(yíng)養(yǎng)菌的底盤改造和異源途徑優(yōu)化表達(dá)提供了重要基礎(chǔ),國(guó)內(nèi)外的研究推動(dòng)了甲醇轉(zhuǎn)化成多種高附加值產(chǎn)品。此外,人們渴望利用傳統(tǒng)基因工程菌作為底盤構(gòu)建合成型甲基菌,以期更高效實(shí)現(xiàn)甲醇催化轉(zhuǎn)化。本文中,筆者綜述了目前甲基營(yíng)養(yǎng)菌,尤其是扭脫甲基桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)、代謝工程改造策略與應(yīng)用以及構(gòu)建合成型甲基細(xì)菌這3個(gè)方面的研究進(jìn)展,以期為甲基微生物催化轉(zhuǎn)化的研究提供借鑒。