冷凍切片機(jī)

低溫恒冷箱冷凍切片制作法

以Shandon As 620 E型恒溫箱冷凍切片機(jī)為例，該機(jī)的箱面上有電子控制板，裝有即時(shí)冷凍鍵和除霜鍵，啟動(dòng)即時(shí)冷凍鍵，機(jī)器馬上進(jìn)行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10分鐘。啟動(dòng)即時(shí)除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15分鐘。有照明鍵一個(gè)，啟動(dòng)該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個(gè)，當(dāng)進(jìn)行一周的工作或者一天的工作后，啟動(dòng)該鍵，可對工作間進(jìn)行消毒。當(dāng)每天工作完畢時(shí)，可啟動(dòng)密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個(gè)按鍵，兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退鍵，兩個(gè)為微小進(jìn)退鍵，還有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時(shí)的進(jìn)退。

冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺，溫度可達(dá)-60℃左右，冷凍箱的中間為一臺切片機(jī)，工作間的溫度在0-30℃間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來。

操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。

④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30℃。

冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會(huì)破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí)，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同的編號，依序切片，這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂。

③放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭取時(shí)間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水分也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水分就存留于組織中，形成了冰晶。

⑤當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。

⑥用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。

冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強(qiáng)熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒有任何變化的情況下被固定起來，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鐘。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鐘。

④ 分化。

⑤ 于堿水中返藍(lán)20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦ 脫水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內(nèi)完成快速制片過程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導(dǎo)體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導(dǎo)體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法已很少使用，因此在這里不作闡述。