石蠟組織切片制作

石蠟切片法包括取材、固定、洗滌和脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與貼片、脫蠟、染色、脫水、透明、封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標本需要數(shù)日，但標本可以長期保存使用，為永久性顯微玻片標本。

應(yīng)根據(jù)要求選取材料來源及部位。例如植物細胞有絲分裂多選取洋蔥根尖，細胞分裂快又便于切取;豬的肝小葉邊界清晰明確;耳蝸以豚鼠的內(nèi)耳易于定位和剝離。材料必須新鮮，擱置時間過久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)藥液--固定液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時的結(jié)構(gòu)。固定能使組織硬化，有利于切片的進行，而且也有媒浸作用，有利于組織著色。固定液的種類很多，其對組織的硬化收縮程度以及組織內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)的作用各不相同。例如純酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般組織，但溶解肝糖和色素。固定液可分為單一固定液及混合固定液。前者有甲醛(乙醛、福爾馬林)、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、鋨酸(四氧化鋨)、重鉻酸鉀及苦味酸等，單一固定液不能固定細胞中的所有成分;混合固定液可以互補不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液(配方見有關(guān)技術(shù)書籍)。因此，應(yīng)根據(jù)所要顯示的內(nèi)容來選擇適宜的固定液。10%福爾馬林(4%甲醛)或10%磷酸緩沖福爾馬林是病理切片常規(guī)使用的固定液，不僅適用于常規(guī)H精-伊紅)染色，還可以用于組織學(xué)有關(guān)的其他技術(shù)的切片染色。固定液的用量通常為材料塊的20倍左右，固定時間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時至數(shù)天，通常為1小時至24小時。

固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會影響后期的染色效果。該步驟稱作洗滌多數(shù)用流水沖洗;使用含有苦味酸的固定液固定的則需用酒精多次浸洗;使用酒精或酒精混合液固定的組織，則不必洗滌，可直接進行脫水。固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，若不除去水分則無法進行以后的透明、浸蠟與包埋處理，原因在于透明劑多數(shù)是苯類，苯類和石蠟均不能與水相融合，水分不能脫盡，苯類無法浸入。酒精為常用脫水劑，它既能與水相混合，又能與透明劑相混。為了減少組織材料的急劇收縮，應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行，通常從30%或50%酒精開始，經(jīng)70%、85%、95%直至純酒精(無水乙醇)，每次時間為1~數(shù)小時，如不能及時進行各級脫水，材料可以放在70%酒精中保存，因高濃度酒精易使組織收縮硬化，不宜處理過久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陸環(huán)等也可做脫水劑。

純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。通常組織先經(jīng)純酒精和透明劑各半的混合液浸漬1~2小時，再轉(zhuǎn)入純透明劑中浸漬。透明劑的浸漬時間則要根據(jù)組織材料塊大小及屬于囊腔抑或?qū)嵸|(zhì)器官而定。如果透明時間過短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織;透明時間過長，則組織硬化變脆，就不易切出完整切片，最長為數(shù)小時。

用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1~2小時，再先后移入2個熔化的石蠟液中浸漬3小時左右，浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點3℃左右的溫箱中進行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。浸蠟后的組織材料塊放在裝有蠟液的容器中(擺好在蠟中的位置)，待蠟液表層凝固即迅速放入冷水中冷卻，即做成含有組織塊的蠟塊。容器可用光亮且厚的紙折疊成紙盒或金屬包埋框盒。如果包埋的組織塊數(shù)量多，應(yīng)進行編號，以免差錯。石蠟熔化后應(yīng)在蠟箱內(nèi)過濾后使用，以免因含雜質(zhì)而影響切片質(zhì)量，且可能損傷切片刀。通常石蠟采用熔點為56~58℃或60~62℃兩種，可根據(jù)季節(jié)及操作環(huán)境溫度來選用。

包埋好的蠟塊用刀片修成規(guī)整的四棱臺，以少許熱蠟液將其底部迅速貼附于小木塊上，夾在輪轉(zhuǎn)式切片機的蠟塊鉗內(nèi)，使蠟塊切面與切片刀刃平行，旋緊。切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當(dāng)都直接影響切片質(zhì)量，可用熱水或冷水等方法適當(dāng)改變蠟塊硬度。通常切片厚度為4~7微米，切出一片接一片的蠟帶，用毛筆輕托輕放在紙上。

用粘附劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后的脫蠟、水化及染色等步驟中二者滑脫開。粘附劑是蛋白甘油。首先在潔凈的載玻片上涂抹薄層蛋白甘油，再將一定長度蠟帶(連續(xù)切片)或用刀片斷開成單個蠟片于溫水(45℃左右)中展平后，撈至玻片上鋪正，或直接滴兩滴蒸餾水于載玻片上，再把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，最后用濾紙吸除多余水分，將載玻片放入45℃溫箱中干燥，也可在37℃溫箱中干燥，但需適當(dāng)延長時間。

干燥后的切片需脫蠟及水化才能在水溶性染液中進行染色。用二甲苯脫蠟，再逐級經(jīng)純酒精及梯度酒精直至蒸餾水。如果染料配制于酒精中，則將切片移至與酒精近似濃度時，即可染色。

染色的目的是使細胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。未經(jīng)染色的細胞組織其折光率相似，不易辨認。經(jīng)染色可顯示細胞內(nèi)不同的細胞器及內(nèi)含物以及不同類型的細胞組織。染色劑種類繁多，應(yīng)根據(jù)觀察要求及研究內(nèi)容采用不同的染色劑及染色方法，還要注意選用適宜的固 定劑才能取得滿意的結(jié)果。經(jīng)典的蘇木精(Hematoxylin)和伊紅(曙紅，Eosin)染色法是組織學(xué)標本及病理切片標本的常規(guī)染色，簡稱HE染色。經(jīng)HE染色后，細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數(shù)細胞質(zhì)及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。由于蘇木精是帶陽離子的染料，染液呈堿性，核內(nèi)染色質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)核糖體等物質(zhì)對這種染料有親和性，稱嗜堿性;而帶陰離子的染料伊紅配制的染液呈酸性，對這種染料的親和性，稱嗜酸性。有時不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，稱特殊染色。有些細胞組織經(jīng)硝酸銀浸潤后，可使溶液中銀離子還原成金屬銀或銀粒附著在細胞組織上，呈棕黑色，這種性質(zhì)稱親銀性，而有些細胞組織本身不能使硝酸銀的銀離子還原成金屬銀，還需加還原劑才能將銀離子還原，稱嗜銀性。

染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度酒精脫水，在95%及純酒精中的時間可適當(dāng)加長以保證脫水徹底;如染液為酒精配制，則應(yīng)縮短在酒精中的時間，以免脫色。二甲苯透明后，迅速擦去材料周圍多余液體，滴加適量(1~2滴)中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現(xiàn)氣泡，封片后即制成永久性玻片標本，在光鏡下可長期反復(fù)觀察。注意有些染料需特定廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品。根據(jù)各種染色方法、組織類別及切片厚度，掌握適宜的染色時間，才能達到較好的染色效果。

石蠟制片程序及環(huán)節(jié)繁多，需數(shù)日才能完成1個周期，但切片可長期保存，供教學(xué)、科研及病理診斷及復(fù)察，并可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。病理常規(guī)制片過程中已簡化了一些細的環(huán)節(jié)或縮短了部分處理時間以適應(yīng)臨床需要(可縮短至2天)。雖然冰凍切片大大快于石蠟切片，但所顯示的形態(tài)結(jié)構(gòu)卻不如后者，因此病理醫(yī)生最后還需要根據(jù)石蠟切片作出準確診斷。近些年來，在病理常規(guī)制片過程中采用了微波技術(shù)，從而大大縮短了制片過程，而且對形態(tài)結(jié)構(gòu)并沒有影響。微波是一種波長很短、頻率卻很高的高頻電磁波[波長為1米 ~1毫米，頻率為300兆赫(MHz)~300千兆赫(GHz)]。組織經(jīng)微波輻射后加速組織內(nèi)部分子的高速運動，以使液體的運輸加快，增加彌散、滲透和交換效率，從而加速組織的固定、脫水、透明、包埋和染色各個環(huán)節(jié)。例如常規(guī)福爾馬林固定需數(shù)小時~1天，而且能引起組織收縮及某些抗原成分不同程度的受到破壞，微波固定僅需1~2分鐘，且可減少抗原的丟失和損害。選擇適當(dāng)?shù)臋n次(功率)、輻射時間和溫度是極為重要的。目前微波技術(shù)的應(yīng)用在國內(nèi)尚處于起步階段，許多技術(shù)應(yīng)用環(huán)節(jié)尚需進一步摸索。

石蠟切片不僅是經(jīng)典的方法，又是最基本的方法，它與其他新的技術(shù)方法相結(jié)合，使傳統(tǒng)的老技術(shù)擴大了應(yīng)用范圍，開辟了許多新領(lǐng)域，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容。隨新的儀器及新的研究技術(shù)的不斷問世及使用，使組織學(xué)的觀察研究從簡單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉(zhuǎn)向定量計測，使細胞組織的形態(tài)，功能及代謝三結(jié)合，從而達到定性可靠、定位準確及定量可測。

石蠟切片(paraffin section) 組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態(tài)變化的主要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他許多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。教學(xué)中，光鏡下觀察切片標本多數(shù)是石蠟切片法制備的?；畹募毎蚪M織多為無色透明，各種組織間和細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別出;組織離開機體后很快就會死亡和產(chǎn)生組織腐敗，失去原有正常結(jié)構(gòu)，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡，而能清晰辨認其形態(tài)結(jié)構(gòu)。