等電聚焦制備電泳系統(tǒng)

在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽(yáng)極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽(yáng)極移動(dòng)，直至某一pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)(pl)。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等電點(diǎn)上聚焦為止?？梢?jiàn)在該方法中，等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。

pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定，重復(fù)性差，現(xiàn)已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負(fù)極間引入等電點(diǎn)彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物，在正極端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負(fù)極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pI最低的分子，帶負(fù)電荷最多，pI1為其等電點(diǎn)，向正極移動(dòng)速度最快，當(dāng)移動(dòng)到正極附近的酸液界面時(shí)，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動(dòng)而停留在此區(qū)域內(nèi)。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點(diǎn)范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pI2，也移向正極，由于pI2>pI1，因此定位于第一種兩性電解質(zhì)之后，這樣，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)按各自的等電點(diǎn)依次排列，形成了從正極到負(fù)極等電點(diǎn)遞增，由低到高的線性pH梯度。

理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過(guò)。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。

pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)(ampholyte，商品名為ampholine)，是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度。

凝膠可用:聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等