活性氧

活性氧正常代謝

體內(nèi)正常代謝可以產(chǎn)生活性氧。線粒體是活性氧的一個重要來源，活性氧族如超氧陰離子自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（OH·）和單線態(tài)氧都是有氧代謝的副產(chǎn)物。在大多數(shù)細(xì)胞中超過90%的氧是在線粒體中消耗的，其中2%的氧在線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)中被轉(zhuǎn)變成為氧自由基。

體內(nèi)的活性氧并不總是有害的，它對機體也有有利的一面。例如，機體內(nèi)吞噬細(xì)胞在細(xì)胞膜受到刺激時，通過呼吸暴發(fā)機制，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 是吞噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬和殺傷作用的主要介質(zhì)。但是在病理條件下，由于活性氧的產(chǎn)生和清除失去了正常平衡，常常會造成活性氧對人體的損傷。

活性氧輻射

人們很早就認(rèn)識到輻射可以在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧。人體內(nèi)的水約占體重的60%，放射線最初的作用就是使水輻射分解，產(chǎn)生H·OH·等，破壞細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)等大分子，最終導(dǎo)致輻射病。T.Herrling 等人通過電子自旋共振（electron spin resonance，ESR） 的方法發(fā)現(xiàn)， 體外實驗的皮膚細(xì)胞在紫外線的作用下可以產(chǎn)生氧自由基，并且這種輻射的效果與輻射強度和射線對皮膚的穿透作用的大小有關(guān)。

活性氧化學(xué)因素

許多化學(xué)藥物如抗癌劑、抗生素、殺蟲劑、麻醉劑、芳香烴類等都可以誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧。高壓氧也可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。M.Chavko 和A.L.Harabin 對在5 個大氣壓下飼養(yǎng)的大鼠進行實驗，可以檢測到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化，同時還原型谷胱甘肽有下降的趨勢，表明有氧化損傷的存在。另外，過渡金屬離子對活性氧的形成很重要，這些離子去除電子的能力是形成和擴展許多毒性極大的活性氧反應(yīng)的基礎(chǔ)。最典型的例子就是鐵催化的Fenton 型反應(yīng)，即毒性較低的過氧化氫在過渡金屬鐵存在的情況下，生成活性極高的羥自由基，從而產(chǎn)生更大的毒害作用。

化學(xué)反應(yīng)法

由于活性氧具有較高的反應(yīng)活性, 它們可以與許多不同的化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng), 由此產(chǎn)生各種不同的反應(yīng)生成物, 根據(jù)這些反應(yīng)生成物或者反應(yīng)物的變化程度可以進行定量或者定性分析。通常采用的儀器分析方法有, 化學(xué)發(fā)光法 、紫外-可見吸收分光光度法 、熒光光度法 、電子自旋探針 以及選擇性電極法等?；瘜W(xué)反應(yīng)法的特點是測定靈敏度高、廉價、操作簡便等。但是, 化學(xué)反應(yīng)法的特異性相對比較差, 一些氧化還原反應(yīng)或者酶催化反應(yīng)往往對測定結(jié)果的判斷產(chǎn)生影響, 一般需要其他分析方法作為比較, 才能獲得滿意的結(jié)論。

化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光測定法是儀器分析中靈敏度最高的方法之一, 已在醫(yī)學(xué)、環(huán)境以及工業(yè)分析等許多領(lǐng)域里得到廣泛的應(yīng)用 。活性氧的化學(xué)發(fā)光研究也是活性氧測定法研究領(lǐng)域中比較活躍的分支之一, 特別是針對H2O2 測定, 有許多靈敏度高、選擇性好的化學(xué)發(fā)光體系 。進年來, 筆者在H2O2 測定方面開發(fā)了一系列高靈敏度的化學(xué)發(fā)光分析法。除此之外, 目前比較成功的活性氧化學(xué)發(fā)光測定法主要有魯米諾法(luminol)、光澤精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。

分光光度法

活性氧的分光光度測定, 最常用的方法有細(xì)胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基還原法 和硝基四氮唑籃(nitro blue tetrazolium ,NBT)還原法 。具有氧化活性的細(xì)胞色素C 被·O-2 還原后, 形成了在波長550 nm 處有強吸收的亞鐵細(xì)胞色素 , 可以用于O-2 的直接測定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被開發(fā)為SOD 的間接定量分析法 。

但是, 活性氧的細(xì)胞色素丙還原法存在著其它還原性物質(zhì), 如HADPA 和還原性酶的干擾, 一般情況下無法直接用于O-2 的定性分析, 需要比較在SOD 的存在下, 是否還有O-2 與細(xì)胞色素丙發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果, 從而判斷O-2 的生成與否。

熒光光度法

與化學(xué)發(fā)光一樣, 熒光分光光光度法也是靈敏度高, 操作簡便的分析方法之一。比較典型的例子是, 二氯熒光素(DCFH)在過氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有螢光的DCF , 可以有效地應(yīng)用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)與NO-2 在酸性條件下發(fā)生反應(yīng), 形成熒光性的1-(H)-萘三氮茂環(huán), 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作為NO 的測定方法。

電子自旋共振法

電子自旋共振法（ESR法） 作為活性氧的化學(xué)反應(yīng)后的檢測方法, 可以理解成是一種自由基的標(biāo)識反應(yīng), 即向活性氧生成的反應(yīng)體系中添加本身帶有不對稱電子的自由基, 這一添加物與活性氧發(fā)生反應(yīng)后失去不對稱電子, 從而導(dǎo)致ESR 信號的變化。

氧是生命運動過程中不可缺少的一種氣體, 人們一旦處于缺氧或者供氧不足的環(huán)境中, 就會感到憋氣的痛苦甚至死亡。所以, 自從1770 年代初英國人Joseph Priestley 發(fā)現(xiàn)氧以來, 氧一直被人們認(rèn)為是一種對人體百益而無一害的氣體。可是, 科學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來的今天, 我們知道, 不管是空氣中的氧還是水中的溶解氧都具有較高的氧化性, 與一般的金屬鐵一樣, 處于空氣中的人體各部位都在不斷地受到氧的腐蝕而“生銹” , 當(dāng)然這種腐蝕與鐵不同, 它體現(xiàn)在人體的細(xì)胞水平上。特別是人體各種器官隨著年齡的增大不斷地老化更是這種腐蝕“生銹”的直觀表現(xiàn)。1969 年McCord 與Fridovich 發(fā)現(xiàn), 在生化反應(yīng)過程中O2 獲得一個電子還原生成超氧自由基(O-2 ), 進而經(jīng)過紅血球的分離精制后獲得O-2 的清除滅活酶, 并命名為超氧化物歧化酶(superoxide dismultase , SOD)。這一發(fā)現(xiàn)激發(fā)了大批的科學(xué)研究者致力于O-2 的生成過程、反應(yīng)活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究, 去探索解明SOD 在生理學(xué)上的意義。同時由O-2 衍生出來的過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)、激發(fā)態(tài)氧(一重態(tài)氧或稱單線態(tài)氧,O2)也受到了人們的重視。

所謂的活性氧, 概括地說, 是指機體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成, 含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱:主要有一種激發(fā)態(tài)的氧分子, 即一重態(tài)氧分子或稱單線態(tài)氧分子(O2);3 種含氧的自由基, 即超氧陰離子自由基(O-2 )、羥自由基(·OH)和氫過氧自由基(HO2);2 種過氧化物, 即過氧化氫(H2O2)和過氧化脂質(zhì)(ROOH)以及一種含氮的氧化物(NO)等。這些物質(zhì)化學(xué)反應(yīng)活性強、存在壽命短, 如O2 的平均壽命為2μs 、·OH 自由基200 μs 、O-2 自由基5 s 。正是由于它們壽命短、反應(yīng)活性高, 到目前為止除了H2O2 以外,其它活性氧的測定仍然是一項國際性難題, 還沒有特別專一有效的方法。一般情況下采用的分析方法可大體有化學(xué)反應(yīng)法 、捕捉法和直接測定法。

對核酸的氧化損傷

DNA 的氧化損傷主要包括：一是堿基的修飾。羥基自由基可對胸腺嘧啶的5，6-雙鍵進行加成，形成胸腺嘧啶自由基。堿基的改變可導(dǎo)致其基團控制下的許多生化與蛋白合成過程受到破壞。二是鍵的斷裂。自由基從DNA 的戊糖奪取了氫原子，使之在C4位置形成具有未配對電子的自由基，然后，此自由基又在β-位置發(fā)生鏈的斷裂。O2也能分解核苷酸，尤其是鳥苷酸，對鳥苷、腺苷、胞苷及尿苷分解的比例為26∶13∶8∶1。受到氧化損傷后的DNA 可能會發(fā)生斷裂、突變以及對熱穩(wěn)定性改變等，從而嚴(yán)重影響了遺傳信息的正常轉(zhuǎn)錄、翻譯過程。

對蛋白質(zhì)的氧化損傷

活性氧對蛋白質(zhì)的作用包括修飾氨基酸，使肽鏈斷裂，形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚合物，改變構(gòu)像和免疫原性等5 個方面。

修飾氨基酸

蛋白質(zhì)分子中起關(guān)鍵作用的氨基酸成分對自由基損害特別敏感，以芳香氨基酸和含硫氨基酸最為突出，不同的自由基對特定氨基酸側(cè)鏈有特殊影響，如超氧陰離子介導(dǎo)甲硫氨酸氧化成為甲硫氨酸亞砜，半胱氨酸氧化成為磺基丙氨酸；羥自由基可以將脂肪族氨基酸α-位置上的一個氫原子去掉；烷氧自由基和過氧自由基等中間產(chǎn)物可以使色氨酸氧化為犬尿氨酸、N-甲基犬尿氨酸和五羥色氨酸。

使肽鏈斷裂

活性氧所致蛋白質(zhì)肽鏈斷裂方式有2 種，一種是肽鏈水解，另一種是從α-碳原子處直接斷裂，究竟以何種方式斷裂取決于活性氧和蛋白質(zhì)的類型、濃度和二者之間的反應(yīng)速率。肽鍵的水解常發(fā)生在脯氨酸處，其機制為活性氧攻擊脯氨酸使之引入羰基而生成α-吡咯烷酮，經(jīng)水解與其相鄰的氨基酸斷開，α-吡咯烷酮成為新的N-末端，可以進一步水解成為谷氨酰胺。肽鏈直接斷裂的方式是活性氧攻擊α-碳原子生成α-碳過氧基，后者轉(zhuǎn)化為亞氨基肽，經(jīng)過弱酸水解為氨基酸和雙羧基化合物。

形成蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合物

多種機制可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚合。蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸可以形成二酪氨酸，半胱氨酸氧化形成二硫鍵，兩者均可以形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)。交聯(lián)可以分為分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)2 種形式。蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和半胱氨酸的數(shù)目可以決定交聯(lián)的形式。另外，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的丙二醛（MDA）與蛋白質(zhì)氨基酸殘基反應(yīng)生成烯胺，也可以造成蛋白質(zhì)交聯(lián)。生物體內(nèi)單糖自動氧化的α-羰醛產(chǎn)物可以與蛋白質(zhì)交聯(lián)而使酶失活，并使膜變形性下降，導(dǎo)致細(xì)胞衰老與死亡。

改變構(gòu)像

蛋白質(zhì)經(jīng)氧化后，熱動力學(xué)上不穩(wěn)定，部分三級結(jié)構(gòu)打開，失去原有構(gòu)像。用H2O2和抗壞血酸-Fe（III）氧化SOD，其紫外吸收增強，內(nèi)源性熒光減弱，表明酶分子由緊密有序排列趨于松散無序。用自旋標(biāo)記研究，探測到較低濃度抗壞血酸-Fe（III）和H2O2，就可以影響到SOD 分子亞基締合或其周圍的結(jié)構(gòu)。

改變免疫原性

用H2O2，或H2O2，-Cu2 和抗壞血酸-Fe（III）體系作用于牛紅細(xì)胞銅鋅超氧化物歧化酶（SOD）， 人血清白蛋白（HAS） 和人IgG， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOD、HAS 和IgG 與其抗體反應(yīng)增強， 提示活性氧可能參與了某些自身免疫性疾病中抗原抗體復(fù)合物的形成過程。

對生物膜的損傷

自由基對生物膜的損傷是作用于細(xì)胞膜及亞細(xì)胞器膜上的多不飽和脂肪酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物脂自由基（L·）、脂氧自由基（LO·）、脂過氧自由基（LOO·）可以與膜蛋白發(fā)生攫氫反應(yīng)生成蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和交聯(lián)。另外，脂質(zhì)過氧化的羰基產(chǎn)物（如丙二醛）也可攻擊膜蛋白分子的氨基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)和分子間交聯(lián)。另一方面自由基也可直接與膜上的酶或與受體共價結(jié)合。這些氧化損傷破壞了鑲嵌于膜系統(tǒng)上的許多酶和受體、離子通道的空間構(gòu)型，使膜的完整性被破壞、膜流動性下降，膜脆性增加，細(xì)胞內(nèi)外或細(xì)胞器內(nèi)外物質(zhì)和信息交換障礙，影響膜的功能與抗原特異性，導(dǎo)致廣泛性損傷和病變。機體中HO·大部分在細(xì)胞器中產(chǎn)生，特別是在線粒體中產(chǎn)生，造成線粒體膜的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞和機體的能量代謝障礙。