纖維素廢棄物熱解液乙醇轉(zhuǎn)化的工程菌構(gòu)建項(xiàng)目摘要

纖維素類廢棄物經(jīng)快速熱解技術(shù)可獲得含主要成分為內(nèi)醚糖(Levoglucosan,1,6-脫水-β-D-吡喃葡萄糖)的熱解液，但自然界仍未發(fā)現(xiàn)直接轉(zhuǎn)化內(nèi)醚糖為乙醇的微生物菌株，從而限制了從纖維素生物質(zhì)經(jīng)熱解，然后直接生物轉(zhuǎn)化為乙醇的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。本研究擬將自行分離獲得的內(nèi)醚糖激酶基因lgk轉(zhuǎn)入產(chǎn)酒量高、抗逆性強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis中，構(gòu)建基因工程菌株，以及采用低能離子束注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建酵母工程菌株，從而實(shí)現(xiàn)纖維素生物質(zhì)熱解液到清潔能源乙醇的有效轉(zhuǎn)化。內(nèi)容包括lgk基因高表達(dá)穿梭載體構(gòu)建，低能離子束注入介導(dǎo)的斯達(dá)油脂酵母基因組DNA在釀酒酵母的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子篩選，以及重組體工程菌對(duì)純內(nèi)醚糖和熱解產(chǎn)物的乙醇轉(zhuǎn)化。本研究將先進(jìn)的基因工程技術(shù)和方法運(yùn)用于能源科學(xué)和環(huán)境科學(xué)問題研究中，屬交叉學(xué)科研究，科學(xué)意義大，同時(shí)也為基于熱解技術(shù)的纖維素廢棄物生物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

基于能源的可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境污染的考慮，可再生能源（如生物乙醇）獲得了越來越多的關(guān)注。纖維素物質(zhì)儲(chǔ)量巨大，熱解技術(shù)可以快速的將它分解成以內(nèi)醚糖為主的熱解液。內(nèi)醚糖不能直接被轉(zhuǎn)化成乙醇，但可以通過酸催化水解成葡萄糖，從而被微生物發(fā)酵，也可以通過基因工程改造獲得乙醇發(fā)酵菌株直接發(fā)酵內(nèi)醚糖生產(chǎn)乙醇。主要成果包括：（1）熱解液經(jīng)過硫酸水解、Ba(OH)2 中和和 2:1體積的乙酸乙酯分三次萃取進(jìn)行脫毒后，改造的大腸桿菌Escherichia coli 11177能有效發(fā)酵水解液為乙醇，所得乙醇產(chǎn)率為0.40 g乙醇/g葡萄糖。但在相同的條件下，Z. mobilis 11020卻不能。發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵，縮短了發(fā)酵時(shí)間。E. coli 的乙醇生產(chǎn)效率可達(dá)到約0.71 g/L h，高于大部分文獻(xiàn)報(bào)道的效率值。構(gòu)建的數(shù)學(xué)動(dòng)力學(xué)模型符合Logistic模型，可準(zhǔn)確描述菌體的生長(zhǎng)，而分別描述基質(zhì)消耗和底物生成的動(dòng)力學(xué)模型 和 能很好的模擬實(shí)測(cè)值，將來有望指導(dǎo)中試生產(chǎn)。（2）對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌進(jìn)行甲酸、乙酸、糠醛、5-羥甲基糠醛和苯酚的細(xì)胞毒性測(cè)試，確定這5個(gè)化合物對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌生長(zhǎng)的抑制濃度分別為0.7、5.3、1.9、9.0和1.7 g/L。而單個(gè)化合物10%的抑制濃度的混合物，即0.07 g/L甲酸、0.53 g/L乙酸、0.19 g/L糠醛、0.9 g/L 5-羥甲基糠醛和0.17 g/L苯酚的混合物，便可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。（3）利用低能離子注入介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)Saccharomyces cerevisiae 2.399進(jìn)行低能N 離子刻蝕發(fā)現(xiàn)，在注入能量為15 keV、注入劑量為10×1015 ions/ cm2的條件下，S. cerevisiae 2.399的細(xì)胞自我修復(fù)作用最強(qiáng)，存活率達(dá)到25%，乙醇產(chǎn)率約為0.42 g乙醇/g葡萄糖（達(dá)到理論產(chǎn)率的84%），與乙醇發(fā)酵相關(guān)的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶酶活值分別約為0.53和2.47（μmol/mL min）。（4）通過三種不同方法嘗試構(gòu)建工程菌，以反轉(zhuǎn)錄得到的內(nèi)醚糖激酶基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建的工程菌利用內(nèi)醚糖的效率最低；其次為進(jìn)一步插入了釀酒酵母信號(hào)肽基因的工程菌；利用內(nèi)醚糖和轉(zhuǎn)化乙醇效率最好的是以優(yōu)化過密碼子的內(nèi)醚糖激酶基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建的工程菌。本研究為大規(guī)模利用纖維素生產(chǎn)生物乙醇提供了一條重要途徑和技術(shù)支撐。 2100433B

利用熱解焚燒技術(shù)處理危險(xiǎn)電子電器類、醫(yī)療類和有機(jī)類等具有一定熱值的危險(xiǎn)性可燃固體廢棄物，將熱解和高溫焚燒技術(shù)優(yōu)化組合，把低溫氣體和高溫熔融結(jié)合起來，將廢棄物的焚燒分為熱解-預(yù)混-焚燒三步進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)熱解焚燒、能量回收和煙氣凈化綜合工藝流程和工藝條件。 2100433B