分子篩層析

根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。

稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應(yīng)根據(jù)不同型號的凝膠而定()。

為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復數(shù)次即可。

層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當。內(nèi)徑過細，會發(fā)生"器壁效應(yīng)"，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為1︰5~1︰25;對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20~1︰100。

裝柱過程基本同離子交換層析柱。

樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%~5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。

洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。

同離子交換層析。

當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種:

⑴ 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑(一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。

⑶ 長期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質(zhì)則進入凝膠孔內(nèi)進行"繞道"運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，流下時路程較長，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運動時，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質(zhì)則進入凝膠孔內(nèi)進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中，作成一個凝膠柱。當含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運動路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。