疏水作用折疊

疏水作用蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的形成

在對(duì)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)有所了解的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)化學(xué)家很自然地希望闡明蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)是如何形成的，即肽鏈?zhǔn)侨绾握郫B的。

從Anfinsen經(jīng)典的核糖核酸酶的還原和重氧化實(shí)驗(yàn)，得出蛋白質(zhì)肽鏈折疊的基本原則：蛋白質(zhì)的氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，即肽鏈的折疊方式。肽鏈折疊的本質(zhì)，可以簡(jiǎn)單地理解為將肽鏈中絕大多數(shù)的疏水殘基包裹到分子內(nèi)部。這種包裹或是說折疊，卻不是任意的。一條肽鏈可以有無數(shù)種可能的折疊方式——空間構(gòu)象，但最終形成的是有活性的特定構(gòu)象。

從蛋白質(zhì)變性研究了解到，肽鏈松散是一個(gè)快速過程，變性后肽鏈在合適條件下的再折疊基本上是變性的逆過程，同樣也是十分快速的。目前對(duì)折疊過程，基本上有2種不同的假設(shè)。一種假設(shè)認(rèn)為，肽鏈中的局部肽段先形成一些構(gòu)象單元即α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)，然后再是二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合、排列形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；另一種假設(shè)認(rèn)為，首先是肽鏈內(nèi)部的疏水作用起作用，產(chǎn)生一個(gè)塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。盡管是不同的假設(shè)，但是很多學(xué)者都認(rèn)為有一個(gè)所謂“熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時(shí)，分子立體的結(jié)構(gòu)再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結(jié)構(gòu)。這些局部調(diào)整可以理解為內(nèi)部一些殘基之間的疏水/親水平衡的“完善”。就糖蛋白而言，整個(gè)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的形成和糖基化也有一定關(guān)系。糖殘基或糖鏈?zhǔn)怯H水性較強(qiáng)的基團(tuán)，加到肽鏈上明顯地改變了分子的疏水/親水平衡。

疏水作用蛋白質(zhì)的新生肽鏈的折疊

近年來，對(duì)蛋白質(zhì)的新生肽鏈在體內(nèi)的折疊研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了許多幫助肽鏈折疊的蛋白質(zhì)，其中有些有利于二硫鍵的交換和配對(duì)(二硫鍵異構(gòu)酶)與脯氨酰參與的肽鍵的異構(gòu)化(肽基脯氨酰異構(gòu)酶)，還有一大類被稱為蛋白質(zhì)伴侶。后者的主要特點(diǎn)是能和疏水性的肽段結(jié)合，一方面避免肽鏈因疏水作用而聚集，另一方面幫助新生肽鏈形成正確的空間構(gòu)象。對(duì)一些具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)伴侶還幫助了亞基間的裝配。在胞質(zhì)中有些蛋白質(zhì)伴侶是由2種亞基構(gòu)成的多聚體，其外形猶如帶有蓋的圓桶，其效果如有魔法的桶，松散的新生肽鏈進(jìn)入，出來的便是有特定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)。

排空效應(yīng)：當(dāng)大顆粒被半徑為R 的小顆粒包圍時(shí)，小顆粒能把大顆粒推到一起，以使小顆粒自身的熵最大。如果兩個(gè)表面精確匹配，則相應(yīng)的單位接觸面積上的自由能減少為：ΔF/A=ckBT×2R，ckBT 是平衡滲透壓的范特霍夫關(guān)系，c=N/V 是溶質(zhì)分子數(shù)密度，kB 為玻爾茲曼常數(shù)，T 為溫度。疏水作用比起其他3 個(gè)次級(jí)鍵，目前還未找到比較有效的計(jì)算方法，主要是模擬水和有機(jī)溶劑中的溶質(zhì)，通過轉(zhuǎn)移自由能ΔG 來計(jì)算分配系數(shù)LogP。

ΔG 液體→水溶液=－RTln（Xaq/Xliq），Xaq、Xliq 是水溶液和與之接觸非極性液體平衡濃度。

疏水作用的本質(zhì)來源于熵力，一個(gè)孤立系統(tǒng)出現(xiàn)平衡態(tài)是熵和能量?jī)煞矫孢_(dá)到最佳折衷的產(chǎn)物?？计澛╓.Kauzmann）1959 年指出為了減少暴露在水中的非極性表面積，任何兩個(gè)在水中的非極性表面積將傾向于結(jié)合在一起。疏水溶劑化的代價(jià)大部分源于熵，疏水效應(yīng)顯著的熵特性，這暗示著隨溫度增高疏水效應(yīng)的增強(qiáng)（前提是溫度不得破壞水中氫鍵的情況下，氫鍵破壞越多疏水表面對(duì)氫鍵形成干擾越小，疏水效應(yīng)減弱）。與排空效應(yīng)是類似的疏水效應(yīng)能夠利用熵呈現(xiàn)出分子的自組裝。

非極性溶劑、去污劑可以破壞疏水相互作用，而高鹽溶液增大疏水作用力，使蛋白溶解度下降出現(xiàn)鹽析，常用于蛋白質(zhì)沉淀。另外生物分子不同的疏水基團(tuán)作用力不同，利用這個(gè)性質(zhì)通過改變洗脫液的鹽-水比例（改變離子強(qiáng)度）而改變其極性，使極性不同的組分根據(jù)疏水性的差異先后被解析下來達(dá)到分離的目的，這又被稱為疏水層析法。簡(jiǎn)單的說就是“高鹽吸附、低鹽洗脫”，這是一種常用的蛋白質(zhì)分離提純方法。尿素、鹽酸胍既能破壞氫鍵又能破壞疏水作用因此是蛋白質(zhì)的強(qiáng)變性劑。

疏水作用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

隨著越來越多的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)被解析，對(duì)蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的一般規(guī)律也日益清楚。

就一個(gè)球狀蛋白質(zhì)而言，它們的表面常被一層親水殘基包圍，帶有疏水側(cè)鏈的殘基原則上處于分子內(nèi)部，但并不是絕對(duì)的。嚴(yán)格地說，整個(gè)蛋白質(zhì)分子由里到外，疏水殘基是逐漸減少，親水殘基則不斷增多。比較而言，親水殘基出現(xiàn)在分子內(nèi)部的幾率大于疏水殘基出現(xiàn)在分子表面的幾率。因?yàn)楹芏鄮в须姾傻臍埢ㄟ^正負(fù)電荷的相互作用而形成鹽鍵，或者是一些殘基的側(cè)鏈參與氫鍵的形成，結(jié)果削弱了殘基的親水性，使某些側(cè)鏈的疏水性質(zhì)更為突出。又例如肽鏈骨架中肽鍵內(nèi)的羰基和亞胺基都有親水和形成氫鍵的特性。球狀蛋白質(zhì)表面也存在著一些疏水殘基，從能量上看，是處于不穩(wěn)定狀態(tài)，它們有變得更為穩(wěn)定的傾向。這些殘基的側(cè)鏈往往成為蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)，參與和其它分子的相互作用；或是參與亞基和亞基的相互作用，形成蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，或是自身、或是和其它分子締合。

疏水作用作用機(jī)理

就膜蛋白而言，其肽鏈中穿越膜的肽段經(jīng)常是形成兩親性α螺旋或β折疊。它們一個(gè)側(cè)面集中了較多的疏水性殘基，相對(duì)的另一側(cè)面存在著不少親水性殘基。有些膜蛋白具有多個(gè)穿越膜的肽段，這些肽段形成的兩親螺旋的疏水面向著膜脂質(zhì)中的脂肪鏈，親水面則背對(duì)脂肪鏈，并且還以特定的方式排列，盡可能地避免和疏水環(huán)境接觸，同時(shí)相互協(xié)同形成某種親水的微環(huán)境。有些一次穿越膜的蛋白質(zhì)也往往表現(xiàn)出有形成二聚或多 聚化的傾向，其結(jié)果也是使穿越膜的肽段在能量上更為穩(wěn)定。

綜上所述，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征是疏水/親水間的平衡，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在很大程度上有賴于分子內(nèi)的疏水作用。當(dāng)然，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的因素不僅是疏水作用，還有氫鍵、鹽鍵和范德華力以及肽鏈內(nèi)的二硫鍵、肽鏈和所含金屬元素間的配位鍵等。但是從各種因素的貢獻(xiàn)看，疏水作用是最重要的。

疏水作用提出

1959年，Kauzmann在《蛋白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展》上發(fā)表了一篇題為“影響蛋白質(zhì)變性的一些因素”的文章，首次明確提出“疏水作用”這一概念。在當(dāng)時(shí)，生物化學(xué)家已經(jīng)知曉蛋白質(zhì)中含有α螺旋和β折疊；一些蛋白質(zhì)和多肽的序列已經(jīng)測(cè)定；但是蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)還正在測(cè)定中。

疏水作用實(shí)驗(yàn)描述

與此同時(shí)，Tanford等為疏水作用的存在提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。從此以后，疏水作用的概念被蛋白質(zhì)化學(xué)家所接受。目前，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)20種氨基酸的疏水特性分別提出了不同的參數(shù)。對(duì)一個(gè)蛋白質(zhì)肽鏈中的每個(gè)氨基酸殘基也通常使用親/疏水作圖法(hydropathy)描述。通過親/疏水作圖法可以了解整條肽鏈中不同肽段的親/疏水性，進(jìn)而可以對(duì)一些處于蛋白質(zhì)分子表面的抗原決定簇及一些膜蛋白中穿越膜的肽段進(jìn)行預(yù)測(cè)。

疏水作用蛋白質(zhì)的傳送

在細(xì)胞質(zhì)中合成的新生肽鏈，有相當(dāng)一部分被傳送并定位到細(xì)胞內(nèi)的不同細(xì)胞器上，或被分泌到細(xì)胞外。折疊成為特定空間構(gòu)象的肽鏈，表面帶有大量的親水基團(tuán)，雖然在細(xì)胞質(zhì)中很容易被傳送，但是不能通過脂質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞器膜。因此，定位在一些細(xì)胞器(例如線粒體)上的蛋白質(zhì)，其新生肽鏈合成后，往往是和某種蛋白質(zhì)伴侶結(jié)合，以屏蔽新生肽鏈表面的疏水殘基，便于傳送，一旦到達(dá)其定位的細(xì)胞器表面，肽鏈和蛋白質(zhì)伴侶解離，依靠前導(dǎo)的信號(hào)肽以及其它一些蛋白質(zhì)復(fù)合體的幫助，或是定位在一些細(xì)胞器的膜中，或是通過細(xì)胞器膜，進(jìn)入細(xì)胞器的腔內(nèi)。進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的新生肽鏈，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的一些(可溶性的或膜結(jié)合的)蛋白質(zhì)伴侶的“質(zhì)量”監(jiān)控下，折疊和組裝為成熟的蛋白質(zhì)。折疊不正確的肽鏈和組裝不正確的寡聚蛋白都不能進(jìn)入高爾基體，因而不能被正確定位到其它細(xì)胞器或被分泌到細(xì)胞外。最近發(fā)現(xiàn)某些脂質(zhì)分子也可以幫助膜蛋白肽鏈的折疊，起到蛋白質(zhì)伴侶的作用。這更說明，只要能降低肽鏈間的疏水作用而使它們不能聚集的分子，不論是蛋白質(zhì)還是脂質(zhì)，都有可能幫助肽鏈折疊形成正確的構(gòu)象，都可成為蛋白質(zhì)伴侶。

疏水作用蛋白質(zhì)的定位

在體液中，一些疏水的分子輸送非常困難。所幸的是，在體液中存在著多種這些疏水分子的運(yùn)載蛋白。不僅有各種不同的載脂蛋白以專一性較廣的方式運(yùn)輸著不同的脂質(zhì)類分子(包括脂肪、膽固醇等)，而且還有一些非常專一的運(yùn)載蛋白負(fù)責(zé)著一些特殊疏水分子的運(yùn)輸，如維生素B12結(jié)合蛋白、視黃醇/甲狀腺素運(yùn)載蛋白(transthyretin)等。同樣，親水分子通過質(zhì)膜，一定要越過能障?？尚牢康氖?，質(zhì)膜中存在著不同類型的離子和分子通道。它們是通過膜蛋白的肽段在質(zhì)膜中以特定方式排列而成的。如一些神經(jīng)遞質(zhì)受體蛋白，多數(shù)由幾個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基又分別有螺旋穿越質(zhì)膜，同時(shí)排列成中間親水的通道。最近還發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白。

介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向與把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象稱為疏水作用，它在穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)方面占有突出地位。疏水作用其實(shí)并不是疏水基團(tuán)之間有什么吸引力的緣故，而是疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出自避開水的需要而被迫接近。

蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)的熵增加是疏水作用的主要?jiǎng)恿Α．?dāng)疏水化合物或基團(tuán)進(jìn)入水中時(shí)，它周圍的水分子將排列成剛性的有序結(jié)構(gòu)即所謂籠形結(jié)構(gòu)(clathrate structure)。與此相反的過程（疏水作用），排列有序的水分子（籠形結(jié)構(gòu)）將被破壞，這部分水分子被排入自由水中，這樣水的混亂度增加即熵增加，因此疏水作用是熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過程。

疏水作用朊病毒

目前，和瘋牛病有關(guān)的蛋白質(zhì)PrP被一些學(xué)者稱為“朊病毒”。瘋牛病的發(fā)生，從分子水平看，是蛋白質(zhì)分子形態(tài)的改變，由原來的單個(gè)球狀分子變成了纖維狀的聚集態(tài)。此外有2個(gè)和早老性癡呆有關(guān)的蛋白質(zhì)，在病變時(shí)也發(fā)生聚集，它們是β淀粉樣蛋白(Aβ)和Tau蛋白。這些蛋白質(zhì)在病變時(shí)的一個(gè)共同特點(diǎn)是，分子中β折疊增加，進(jìn)而導(dǎo)致分子聚集，對(duì)蛋白水解酶的抗性增大。瘋牛病的發(fā)生，既沒有也不需要有DNA復(fù)制，也沒有作為病原體的蛋白質(zhì)增加，因此，將PrP稱為“朊病毒”并不確切。將瘋牛病等有關(guān)的疾病稱為蛋白質(zhì)“構(gòu)象病”更合適。發(fā)生瘋牛病時(shí)，PrP中一些α螺旋如何轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B"_blank" href="/item/氨基酸殘基">氨基酸殘基構(gòu)成的肽段，經(jīng)酶解斷裂后很容易聚集。可能在前體分子中，這段肽和分子內(nèi)的其它肽段存在著相互作用，故不發(fā)生該肽段間的相互作用，一旦從完整分子中游離出來，就可能和同樣的碎片肽段聚集。

疏水作用“構(gòu)象病”

在正常情況下，Tau蛋白分子中有很多絲氨酸和蘇氨酸被單個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖基化(O-GlcNAc化)，但是病變時(shí)，同樣的位點(diǎn)不再O-GlcNAc化，而是被磷酸化。表面看來，這2類基團(tuán)都是親水的，但O-GlcNAc是中性的，而被磷酸修飾后則變?yōu)樗嵝?。相鄰的成簇的磷酸基團(tuán)間的排斥力，可能會(huì)導(dǎo)致Tau蛋白的構(gòu)象改變，致使分子內(nèi)的相互作用變成分子間的相互作用，最終同樣會(huì)形成長(zhǎng)的纖維。

因此，蛋白質(zhì)“構(gòu)象病”在蛋白質(zhì)的研究中，絕對(duì)不是孤立的現(xiàn)象，完全應(yīng)該也可能，從疏水作用、親水/疏水平衡的角度，與蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)的裝配、蛋白質(zhì)的別構(gòu)現(xiàn)象聯(lián)系起來進(jìn)行研究。

疏水作用色譜保留機(jī)理與反相色譜基本相同，所不同的是其固定相的疏水性不如反相固定相強(qiáng)，多為低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。疏水作用色譜主要用于蛋白質(zhì)的分離與純化。2100433B

疏水作用色譜法h川raphohir intert3}tion rhromato}raphy使用適度疏水性的固定相，以含鹽的水溶液作為流動(dòng)相，藉疏水作用分離生物大分子化合物的液相色譜法。

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排空效應(yīng)是疏水作用（疏水力實(shí)質(zhì)是熵和自由能的混合效應(yīng)）的理想情況，而滲透壓是使大分子產(chǎn)生這種排空力的原因。滲透壓可以看成單位體積內(nèi)的自由能變化。排空效應(yīng)是小顆粒能把大顆粒推到一起，以使小顆粒自身的熵最大，如果兩個(gè)表面精確匹配，則相應(yīng)的單位接觸面積上的自由能減少為ΔF/A=ckBT×2R，R 為小顆粒半徑（這里的c不是濃度是分子數(shù)密度）。

小顆粒能夠有效的幫助大分子找到彼此特異性識(shí)別位點(diǎn)，在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用血清蛋白（BSA）和聚乙二醇（PEG）充當(dāng)小顆粒，它們稱為阻塞試劑。比如他們可以幫助脫氧血紅蛋白和其他大蛋白粘在一起，溶解性降低10 倍；葡聚糖或PEG 能穩(wěn)定復(fù)合物不受熱分解，可以使DNA 溶解度增加若干；PEG 和BSA 還能使機(jī)動(dòng)蛋白絲自組裝速率或不同酶的活性增加幾個(gè)數(shù)量級(jí)；在大腸桿菌DNA 復(fù)制系統(tǒng)中如果不加入阻塞試劑就不能工作。選擇何種阻塞試劑并不重要，關(guān)鍵是他相對(duì)組裝分子的尺度及數(shù)密度。這是無序狀態(tài)過程中同時(shí)驅(qū)動(dòng)的有序組裝，這個(gè)的有序是以更小顆粒更大的無序?yàn)榇鷥r(jià)的。